Barnaba urodził się na Cyprze w żydowskiej rodzinie z pokolenia Lewiego. Jego właściwe imię brzmiało Józef, ale Apostołowie dali mu przydomek Barnaba.

Według Klemensa Aleksandryjskiego i Euzebiusza Barnaba miał należeć do grona 72 uczniów Pana Jezusa. Był krewnym św. Marka Ewangelisty. Po ukończeniu 12 lat Barnaba (Józef) został wysłany do Jerozolimy na naukę w szkole Gamaliela. Tu uczył się znajomości Tory i poznawał księgi Pisma, czyli proroków i księgi mądrościowe. Zasadniczo ten etap jego życia jest dość pewny, gdyż pochodząc z rodu Lewiego, miał obowiązek nauki w tej szkole. W Piśmie Świętym pierwszą wzmiankę o św. Barnabie znajdujemy w Dziejach Apostolskich w rozdziale 4, w wersie 36: »Tak Józef, nazwany przez Apostołów Barnabas, to znaczy „Syn Pocieszenia”, lewita rodem z Cypru, sprzedał ziemię, którą posiadał, a pieniądze przyniósł i złożył u stóp Apostołów.«

Św. Paweł po swoim nawróceniu udał się najpierw do Barnaby, by pośredniczył pomiędzy nim a Apostołami (Dz 9, 26-27). Barnaba przekonał resztę uczniów Pańskich, aby zaufali dawnemu prześladowcy Chrystusa Pana, ponieważ jest on człowiekiem uczciwym i jego nawrócenie jest szczere. Wyruszyli następnie na duchowy podbój ziem dla Królestwa Bożego. Barnaba wraz ze św. Pawłem udał się do Antiochii, gdzie pozyskali wielką liczbę wiernych dla Chrystusa. Był to rok 42 po narodzeniu Pana Jezusa. Barnaba i Paweł swoje nauczanie kierowali najpierw do Żydów. Kiedy jednak ci ich odrzucili, poszli do pogan. Aby jednak neofitów nie zrazić, nie nakładano na nich żadnych obowiązków prawa mojżeszowego, a żądano jedynie, by dawali świadectwo Chrystusowi przez przyjęcie chrztu i życie zgodne z Ewangelią. Wieść o tym dotarła jednak do gminy jerozolimskiej, która pilnie przestrzegała prawa mojżeszowego. Barnaba po raz pierwszy wprowadził Pawła do gminy żydowskiej. Obaj Apostołowie bronili tam swojego kierunku działania wobec nawróconych z pogaństwa. Ich stanowczymi przeciwnikami byli natomiast nawróceni Żydzi. Sprawę rozstrzygnął na korzyść Barnaby i Pawła św. Piotr, a poparł go św. Jakub Młodszy. Ustalono, że wolno nawracać pogan, kiedy w danym mieście Żydzi nie przyjmą nauki Chrystusa Pana, oraz że nawróconym z pogaństwa nie należy narzucać obowiązku zachowania prawa mojżeszowego (Dz 15, 1-35).

Barnaba był człowiekiem dobrym, pełnym Ducha Świętego i wiary (Dz 11, 22-24). Razem ze św. Markiem jako towarzysze św. Pawła udali się w pierwszą podróż misyjną na Cypr, a stamtąd do Azji Mniejszej (Dz 13, 1-14). Na Cyprze dokonali nawrócenia namiestnika wyspy, Sergiusza Pawła. Kiedy w miasteczku Perge św. Paweł uzdrowił człowieka chromego, „na widok tego, co uczynił Paweł, tłumy zaczęły wołać po likaońsku: «Bogowie przybrali postać ludzi i zstąpili do nas». Barnabę nazwali Zeusem, a Pawła Hermesem, gdyż głównie on przemawiał. A kapłan Zeusa, który miał świątynię przed miastem, przywiódł przed bramy woły i przyniósł wieńce, i chciał z tłumem złożyć (im) ofiarę. Na wieść o tym Apostołowie Barnaba i Paweł rozdarli szaty (…) Zawiedziony tłum od entuzjazmu przeszedł do wściekłości”. Pobudzeni przez Żydów z Ikonium poganie omal nie pozbawili Apostołów życia, św. Pawła ukamienowali, ale cudem wyszedł z ich rąk (Dz 14, 1-21).

Według podań Barnaba działał też w Rzymie i Aleksandrii, a przez kilka lat był biskupem Mediolanu, gdzie założył wspólnotę chrześcijańską. Przekazał wszakże ten urząd jednemu ze swych uczniów i wyruszył w swą ostatnią podróż na Cypr, gdzie miał zyskać palmę męczeńską. Został pojmany w Salaminie, uprowadzony za miasto i ukamienowany, a jego ciało pochował jego wierny towarzysz Marek. W czasie prześladowań zaginęła wieść o miejscu pochówku Apostoła, potem jednak objawił się on jednemu z biskupów antiocheńskich, który odnalazł doczesne szczątki Barnaby wraz księgą Ewangelii, tak jak pochował go święty Marek.

Św. Barnaba cieszył się dużą popularnością. Świadczą o tym liczne apokryfy: Dzieje Barnaby, Ewangelia Barnaby oraz List Barnaby. Dzieje Barnaby powstały ok. 400 roku na Cyprze i opisują walki, jakie Apostoł musiał staczać z Żydami, którzy mieli go spalić żywcem, a jego prochy miał zebrać wspomniany ze czcią św. Marek. Ewangelię Barnaby mieli napisać gnostycy. Jest wspomniana w pismach niektórych ojców apostolskich, ale jej treści bliżej nie znamy. Ciekawym dokumentem jest List Barnaby z wieku II, w którym autor poleca alegorycznie tłumaczyć teksty Pisma świętego. Teologicznie cenną jest druga część tego Listu, mówiąca o preegzystencji Chrystusa Pana, o tajemnicy Jego wcielenia i o dwóch drogach – światła i ciemności.

Kult św. Barnaby był już w czasach apostolskich tak wielki, że tylko jemu jednemu z uczniów Dzieje Apostolskie nadają zaszczytny tytuł Apostoła. W roku 1530 św. Antoni Maria Zaccaria założył zakon Regularnych Kleryków Św. Pawła, od macierzystego kościoła św. Barnaby zwany popularnie barnabitami.

Barnaba jest patronem Florencji i Mediolanu, w którym według tradycji nauczał; czczony jest także jako orędownik podczas kłótni, sporów, smutku oraz burz gradowych.

W ikonografii Barnaba przedstawiany jest z kijem pielgrzymim, kamieniem lub księgą, albo symbolem męczeństwa – gałązką oliwną.